Introdução: Em média no Brasil são registrados 3.017.668 nascidos vivos com uma taxa de 10,78% de nascimento pré-termo. Assim, é de extrema relevância a criação de instrumentos que fortaleçam a qualidade de vida de crianças prematuras, como proposto de forma inédita neste estudo. Objetivos: Elaborar um manual, direcionado à equipe de enfermagem, para orientar a coleta de amostras de sangue de cordão umbilical para realização de exames laboratoriais em prematuros. Metodologia: Pesquisa metodológica, descritiva, de natureza quantitativa. As diretrizes e recomendações Prefered Reporting Itens for Systematic Reviews and Meta-Analyses subsidiaram a elaboração do manual. A etapa de validação contou com a avaliação de 7 enfermeiros especialistas na coleta de sangue do cordão umbilical, para validar a aparência e conteúdo, subsidiado pela técnica Delphi; a análise semântica foi realizada pela equipe de enfermagem (40 partícipes). Para a validação foi utilizado um formulário contendo a avaliação geral e a avaliação específica dos itens do manual, utilizando a escala ordinal de Likert. Para a análise dos dados foi considerada a porcentagem de concordância absoluta e o Índice de Validade de Conteúdo (IVC). A taxa superior a 0,78 foi estabelecida para validação. Estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa, parecer número 4.865.040. Resultados: O manual foi intitulado “Manual de coleta de amostras de sangue de cordão umbilical para realização de exames laboratoriais”, com 27 páginas e 11 capítulos (1) Apresentação, 2) Introdução, 3) Objetivo, 4) Equipe responsável pela coleta, 5) Recém-nascidos elegíveis para a coleta, 6) Exames a serem coletados 7) Como realizar a coleta 8) Material a ser utilizado na coleta, 9) Procedimento técnico, 10) Fluxograma - coleta de amostras do sangue de cordão umbilical, 11) Passo a passo - coleta de amostras do sangue de cordão umbilical). Há também 11 figuras, checklist do material, fluxograma e passo a passo com 6 itens. Foi realizado o registro do ISBN nº 978-65-00-43552-8 e publicado em plataforma digital. A validação do conteúdo e da aparência pelo grupo de especialistas alcançou um IVC de 0,97. A análise semântica efetuada pela equipe de enfermagem atingiu um índice de concordância de 99,9%. Conclusão: A existência de um manual inédito para orientar a equipe de enfermagem nessa temática, vai contribuir para melhores práticas assistenciais, melhoria de indicadores e fortalecimento da cultura de segurança do paciente.