Introdução: O processo de esterilização é fundamental para garantir a segurança dos pacientes em procedimentos hospitalares. No processo de esterilização por peróxido de hidrogênio, os indicadores biológicos são utilizados para verificar se houve a completa eliminação de microrganismos, incluindo esporos bacterianos, e são essenciais para monitorar a eficácia do processo de esterilização. Objetivo: Relatar a experiência da leitura de indicadores biológicos no processo de esterilização com peróxido de hidrogênio. Método: Estudo descritivo do tipo relato de experiência, realizado em um hospital público do Piauí. Foram utilizados indicadores biológicos para monitorar a eficácia da esterilização com peróxido de hidrogênio. Os resultados foram acompanhados e registrados. Resultados/Discussão: Durante o ano de 2023, foram concluídos 78 ciclos de esterilização por peróxido de hidrogênio, destes, 13% apresentaram testes biológicos positivos, indicando a presença de microrganismos resistentes após a esterilização. Após investigação, foi constatado que a ocorrência desse fato estava restrita a um período específico, no qual houve uma mudança na marca dos testes biológicos utilizados. Apesar de terem sido seguidas as recomendações dos fabricantes quanto às condições de incubação dos indicadores, verificou-se que os novos lotes utilizados apresentavam problemas de confiabilidade. Diante dessa constatação, foi adotada uma medida cautelar: a retenção de todas as cargas processadas durante este período. O monitoramento contínuo permitiu identificar falhas no processo e realizar os ajustes necessários. Após a adoção dessa medida, a equipe voltou a utilizar os indicadores biológicos de sua marca de confiança habitual e os resultados dos testes voltaram a ser negativos. Considerações finais: O monitoramento contínuo dos indicadores biológicos se mostrou fundamental para garantir a eficácia do processo de esterilização com peróxido de hidrogênio. Além disso, ao longo do tempo, a maior eficiência do processo diminuiu a necessidade de reprocessamentos, reduzindo os custos com insumos e manutenção dos equipamentos de esterilização. A adoção do peróxido de hidrogênio como agente esterilizante conferiu ao hospital uma imagem de instituição atualizada e comprometida com a qualidade e segurança do paciente.