Introdução: A dor pode prejudicar o comportamento e a adaptação ambiental de recém-nascidos. A punção de calcanhar (conhecida no Brasil como Teste do Pezinho) é uma das principais causas de dor dentre os procedimentos em recém-nascidos, e faz parte dos programas de triagem neonatal biológica de vários países. Métodos não farmacológicos mostram-se eficazes para o alívio da dor durante a realização desse procedimento, sendo a musicoterapia uma opção de baixo custo. Objetivo: Avaliar a dor associada à punção de calcanhar na triagem biológica neonatal. Metodologia: Estudo piloto realizado na Unidade Básica de Saúde, referência para o Teste do Pezinho, no município. A população do estudo foram os binômios: recém-nascidos de zero a 28 dias e mães de recém-nascidos de zero a 28 dias. Os participantes foram aleatoriamente distribuídos em três grupos: grupo intervenção 1 (recém-nascidos que ouviram canção de ninar cantada pelas mães); grupo intervenção 2 (recém-nascidos que ouviram canção de ninar gravada pela musicoterapeuta pesquisadora); e grupo controle (recém-nascidos que não ouviram canção de ninar). Para coleta de dados, aplicou-se a Neonatal Infant Pain Scale (NIPS) para avaliação da dor em neonatos. Padronizou-se a técnica de coleta do Teste do Pezinho em todos os grupos, conforme o Manual Técnico Triagem Neonatal Biológica. Empregou-se análise descritiva e inferencial. Obteve-se aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Piauí sob parecer nº 6.038.004. Resultados: Elegeram-se 43 binômios e 15 não atenderam aos critérios de inclusão, sendo 28 aleatorizados nos grupos: canção de ninar cantada pela mãe (10), canção de ninar gravada e cantada por musicoterapeuta (08), e controle (10). Identificou-se que a média de dor entre o grupo intervenção 1 foi de 2,3, enquanto do grupo intervenção 2 foi de 2,2, e do grupo controle foi de 4,1. Os resultados demonstram discreta diferença na reação à dor dos recém-nascidos que ouviram canção de ninar cantada pela mãe e dos que ouviram a gravada por musicoterapeuta em comparação ao grupo controle, com diferença de 1,80 e 1,75, respectivamente. Não se verificou preferência pela voz materna em relação à gravada. Os recém-nascidos do grupo intervenção apresentaram maior escore de dor, porém sem diferença significativa. Conclusão: Recém-nascidos que ouviram canção de ninar gravada por musicoterapeuta apresentaram menos dor, choraram menos e ficaram mais confortáveis em comparação ao grupo controle.