A persistência e resistência de microrganismos em superfícies hospitalares causam infecções preocupantes em pacientes. Este estudo verificou a ação da oleuropeína (OLE) e do hipoclorito de sódio, 1% (HS) isolados e misturados contra Staphylococcus aureus (SA) em suspensão, mantidas sob -80ºC em Brain Heart Infusion, glicerol 15% (v/v), armazenados no laboratório de Microbiologia da UNIP São José do Rio Pardo/SP. A resistência a sanitizantes foi avaliada pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) para SA (cepa ATCC 25923) Laborclin® Brasil, utilizando-se o método de diluição em caldo, que mede quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano e incubados a 37ºC/24 h para comparação visual dos tubos. Para o método disco difusão em ágar (DDA), após correção das bactérias em 108 UFC (escala 0,5 McFarland) foram plaqueadas pela técnica swab de algodão padronizado, esterilizado, para espalhamento da suspensão na placa de Petri contendo TSA (Ágar Tríptico de Soja, Sigma-Aldrich). Colocou-se discos de 6mm de papel filtro, esterilizados, embebidos nos sanitizantes e incubados em estufa a 37ºC/24h, seguida da leitura dos halos de inibição. Os resultados para a CIM foram iguais para HS e HS+OLE (diluição 1:2, 25%) e OLE (1:2, 50%). Para DDA, OLE (0,03% p/v 8.7 ± 0.8) mostrou maior halo de inibição. Conclui-se que OLE, agente natural, tem ação antimicrobiana e que os efeitos do sanitizante químico HS perdem efeito quando são diluídos, então recomenda-se que a limpeza de superfícies não tenha diluições do sanitizante em água para ter mais eficácia na inibição total das bactérias.