Introdução: O Testamento Vital (TV) se constitui como uma das Diretivas Antecipadas de Vontade (DAV). Trata-se de um documento escrito pelo qual uma pessoa consciente, expressa sua vontade quanto aos tratamentos médicos que aceita/recusa (exceto recusa de cuidados paliativos), quando estiver impossibilitado de manifestar sua vontade. No Brasil não há norma jurídica que regulamente o TV, porém pode ser apoiado em outras leis, princípios e na resolução 1995/2012 publicada pelo Conselho Federal de Medicina. Objetivos: Analisar o conhecimento dos profissionais de saúde sobre testamento vital, identificar o perfil sociorreligioso e correlacionar o exercício profissional e o tempo de profissão com as respostas. Metodologia: Estudo do tipo transversal com instrumento de coleta de dados com perguntas fechadas referentes ao Testamento Vital. Foram selecionados enfermeiros e médicos que prestaram assistência direta ao paciente, entre julho de 2017 a julho de 2018 num hospital em Manaus (AM). Os dados foram tabulados e caracterizados no programa Excel, utilizando para análise o Teste Qui-quadrado de Pearson e o Teste t-Student, considerando achados estatisticamente significativos aqueles com valor de p < 0,05. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Estado do Amazonas. Resultados: Participaram 96 profissionais da saúde, sendo 41(42,7%) enfermeiros, e 55(57,3%) médicos, destes, 46(47,9%) eram mulheres e 49(51%) homens. A maioria referiu uma criação religiosa 64(66,7%) com predominância da religião católica 52(54,2%). Foi observado um conhecimento regular sobre TV entre os profissionais de saúde com a média geral de acertos (± desvio padrão) de 53,7±17,8%. Entre os enfermeiros a média de acertos foi de 57,1±16,5% e dos médicos 54,1±18,0% (p=0,422). Houve diferença estatisticamente significativa nos acertos das respostas dos enfermeiros em relação ao registro em prontuário ser considerado uma diretiva antecipada de vida/testamento vital e possuir suporte legal e ético (p=0,046). Conclusão: Esses dados sugerem a necessidade de esclarecimento para os profissionais bem como maior divulgação e discussão sobre o tema, visto que em outros estados do Brasil o tema já vem sendo discutido.