Após o primeiro caso de contágio acidental de HIV/AIDS em um profissional de saúde houve uma preocupação maior com a biossegurança, sendo necessária a criação de medidas preventivas que devem ser adotadas por todos os profissionais que conferem assistência aos pacientes, independente do diagnóstico. A Enfermagem, por se encontrar mais tempo prestando cuidados ao usuário, deve utilizar os equipamentos disponíveis como também ter suas práticas e comportamentos livre de discriminação e temor. O objetivo geral do estudo foi analisar a relação entre o conhecimento de biossegurança e sua prática efetiva na assistência de enfermagem ao usuário soropositivo no Hospital de Urgências e Traumas (HUT), em Petrolina-PE, em 2011. Os objetivos específicos foram identificar o conhecimento dos profissionais acerca das medidas de biossegurança; a investigação à adesão de medidas em biossegurança pela enfermagem diante do conhecimento da soropositividade do usuário para HIV/AIDS e a descrição das ações realizadas pela equipe de enfermagem diante de acidentes de trabalho com perfurocortantes. Trata-se de uma pesquisa descritiva, exploratória, com abordagem qualitativa, realizada nas clínicas médica e cirúrgica do HUT na cidade de Petrolina- PE. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa, da Universidade Federal do Vale do São Francisco, sob parecer CAAE nº: 0005.0.441.441-11. A pesquisa teve como sujeitos 02 enfermeiras e 05 técnicos de Enfermagem, que prestavam assistência nas clínicas médica e cirúrgica do HUT na ocasião da pesquisa e que foram submetidos a uma entrevista através de um instrumento semi-estruturado. Após coleta dos dados, procedeu-se a análise utilizando-se o método e análise de conteúdo. Foram obtidas 03 categorias e 02 subcategorias de análise. A interpretação dos resultados identificou que os sujeitos tinham conhecimento acerca de biossegurança, mas havia alterações na sua prática profissional após o conhecimento da doença do cliente assistido, atreladas ao medo, preconceito ou à falta de conhecimento sobre a forma de transmissão da infecção. Concluiu-se, portanto, que existia uma deficiência na prestação de cuidados a esses usuários, sendo necessário a implementação de ações educativas permanentemente direcionadas aos profissionais atuantes no hospital em estudo visando aumentar a compreensão dos riscos ocupacionais e uma assistência efetiva e segura aos clientes.